普通油茶花发育和遗传转化体系构建初步研究

【摘要】普通油茶（CamelliaoleiferaAbel）是我国油茶栽培的主要物种，是典型的花果同时发育多年生常绿树种，开花是油茶产量形成的重要基础。本文分析了普通油茶花发育过程生理生化变化及其影响因子，初步探明了油茶的成花过程生化指标的变化动态，并通过花芽发育过程的转录组和表达谱测序及分析，分离了影响油茶花发育关键基因（FT和PI），并构建了FT基因的超表达和PI基因RNAi干扰植物遗传转化载体以及初步的遗传转化系统，具体结果如下：1.随着普通油茶花芽分化，老叶中可溶性蛋白含量逐渐下降，茎可溶性蛋白含量逐渐上升，新叶中可溶性蛋白含量变化相对平稳；老叶中可溶性糖含量逐渐下降，新梢组织（上叶、下叶和茎）可溶性糖含量变化相对平稳；茎的蔗糖含量上升幅度明显，叶片的蔗糖含量呈“下降-上升-下降”变化趋势；新梢各组织（上叶、下叶和茎）中果糖含量变化趋势相似，呈“下降-上升-下降-上升”趋势，新叶含量比茎高，茎比老叶高；植物激素含量新叶比老叶和茎高，其中含量最高的是脱落酸；新叶的生长素与细胞分裂素比值变化趋势较平缓，而茎和老叶的生长素/细胞分裂素比值变化幅度较大。2.普通油茶花器官形成过程，春梢上各部位组织（上叶、下叶和花芽）中可溶性蛋白和可溶性糖含量呈缓慢上升趋势；蔗糖和果糖变化幅度较大，花芽中的含量普遍比叶片中低；春梢叶片各种激素含量呈“下降-上升-下降”，春梢各部位组织中脱落酸与生长素比值呈“上升-下降-上升-下降”变化，生长素与细胞分裂素比值在花芽中变化平缓，在叶片中呈“下降-上升-下降”变化，上叶和下叶中的比值变化相反。3.在普通油茶花芽转变期，在短日照处理下，可溶性蛋白和可溶性糖新叶部位含量最高，蔗糖在实生苗的老叶部位含量最高；在水分处理条件下，老叶中蔗糖含量明显低于新叶；叶片中的果糖含量在氮素处理时含量最高，在短日照时含量最低；茎中生长素含量普遍比叶片中低，新叶比老叶高，新叶在热处理下生长素含量最高，在光照处理及实生苗中较低；赤霉素含量最高是在生长素处理时的新叶部位，最低为对照处理的茎部位；细胞分裂素含量最高为细胞分裂素处理的新叶部位，脱落酸在春梢不同部位含量变化差异不明显；短日照下的普通油茶茎尖FCA基因相对表达量最高，FLC基因在实生苗茎中表达量最高，FT基因在长日照时茎尖表达量最高。4.转录组测序总共获得28,448,847个reads和5,742,023,480pb碱基，GC含量为46.52%；N50长度为806，普通油茶与葡萄的Unigenes相似度最高，总共SSR数量为8,399个，1kb以上的Unigenes有12,643条，占Unigene库总数的13.38%；Unigenes各数据库功能注释数目依次为：在COG中有9,095条，在GO中有27,201条，在KEGG中有6,431条，在Swissprot中有24,534条，在TrEMBL中有36,393条，在nr中有36,400条，在nt中有30,858条；茎尖中FLC、FCA和FT基因表达量普遍较AP1、AP2和PI基因低，FT基因是油茶成花的关键基因，PI基因与雄蕊发育关系紧密。5.通过对普通油茶花发育的6个时期样品测序，共获得了原始reads数为103,249,386条，平均CycleQ20都为100%，各样品测序reads与转录组部分测序构建的Unigene库的序列对比，对比效率都超过60%，样品间的差异基因分析，共获得了差异表达基因为26,861个。5月9号和8月25日的差异表达基因最少，7月3日和6月15日与其他时期差异表达的基因数量最多。6.普通油茶FT基因编码区序列长度为540pb，编码179个氨基酸，FT基因编码的蛋白有一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族（BP）的结构域，与中华猕猴桃的FT基因编码蛋白同源性最高；PI基因编码区序列长度为627，共编码208个氨基酸数，PI基因编码的蛋白有一个MADS-box和K-box蛋白结构域，该蛋白和大豆及四季豆PI基因编码的蛋白同源性最高。7.MS培养基是普通油茶体胚再生最适宜的培养基，长林53号品种较易诱导出胚性愈伤组织，7月27日左右的未成熟胚最容易诱导出体胚，TDZ、2.4-D是体胚诱导最重要的激素，2.4-D、KT、TDZ和CH添加物配比最有利于体胚诱导。选择MS培养基，2mg/L浓度的IAA，0.5mg/L浓度的KT，0.5mg/L浓度的TDZ和500mg/L浓度的CH等组合，有适合于体胚萌发和胚状体生长。8.愈伤组织的潮霉素选择压为120mg/L；外植体预培养时间长短、农杆菌侵染时间长短、共培养时间长短及AS浓度大小对抗性愈伤组织选择都有显著影响，侵染时间对抗性愈伤组织选择影响最为明显，其次是共培养时间、AS浓度和预培养时间；侵染时间、共培养时间及AS浓度大小对农杆菌污染都有极显著影响，侵染时间和AS浓度对农杆菌污染影响最为关键，其次是侵染时间；预培养时间为40d，侵染时间为20min，共培养时间为5天，AS浓度为200mg/L时抗性愈伤组织最多，农杆菌污染率最低。
【作者】胡玉玲；
【导师】姚小华；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，林木遗传育种，2014，博士
【关键词】普通油茶；花发育；生理生化；转录组；遗传转化；

【参考文献】
[1]洪宇航.中华绒螯蟹（Eriochier sinensis）血细胞组成、功能及体外培养的研究[D].上海海洋大学,水产养殖,2013,硕士.
[2]周捷.季铵类苯并菲啶生物碱及其衍生物对色氨酸脱羧酶抑制活性的研究[D].湖南中医药大学,药物化学,2014,硕士.
[3]王艳艳.京剧唱腔在民族声乐演唱中的借鉴与应用[D].山东师范大学,艺术（专业学位）,2013,硕士.
[4]吴旭兰.β-catenin、VEGF-C与P-gp在结直肠癌组织中的表达及相关性研究[D].大连医科大学,肿瘤学,2012,硕士.
[5]费良阅.RORC2转录活性与寻常型银屑病血热证的相关性及凉血解毒汤的干预作用[D].北京中医药大学,中西医结合皮肤病,2013,硕士.
[6]王全.双行星排式混合动力汽车构型分析及协调控制[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[7]程浩.计算机综合仿真实验系统的研究与开发[D].陕西科技大学,化工过程机械,2013,硕士.
[8]澈丽蒙.图书馆随书光盘在线管理系统的设计和实现[D].内蒙古大学,软件工程,2013,硕士.
[9]龙铨.关联词“所以说”及其对外汉语教学[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[10]张楠.邮政薪酬集中发放系统的开发与实现[D].西安电子科技大学,软件工程,2012,硕士.
[11]张静,徐政,潘武略.VSC-HVDC系统新型广义直流电压控制策略[J].电力系统自动化,2008,21:46-50.
[12]崔全江.醇溶性商用聚合物修饰透明阴极的倒装聚合物太阳能电池[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[13]冉冉,刘建平,朱家壁,王纠.功能化碳纳米管在药物递送系统中的应用[J].药学服务与研究,2013,03:170-173.
[14]曹泽宇.分析观点下的多值理想层[D].中国科学技术大学,基础数学,2014,硕士.
[15]张守鑫.上市公司私有化法律制度研究[D].浙江财经学院,经济法学,2012,硕士.
[16]陈玲.清代龙袍所象征的精神世界[D].武汉纺织大学,美学,2014,硕士.
[17]张瑞青.体重因素对妊娠期高血压疾病发病的影响[D].郑州大学,妇产科学,2012,硕士.
[18]王希,谢云婷.公共文化服务体系建设中乌兰牧骑发展研究——基于SWOT方法的分析[J].管理观察,2014,12:161-165.
[19]鲍杨.基于陕北某中学高二学生英语阅读焦虑的实证研究[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[20]柯科峰.基于软件构件的分布式国际货运代理系统的应用研究[D].东华大学,2004.
[21]李萃芸.论生产、销售不符合安全标准的食品罪及其立法完善[D].广东财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[22]刘学.多层石墨烯膜层及其纳微米图案化结构[D].吉林大学,2014.
[23]赵玉信.基于直线运动单元的直角坐标机器人系统的研究[D].齐鲁工业大学,机械电子工程,2014,硕士.
[24]万百五.辨识应用上的新成果第五届国际辨识和系统参数估计会议部分论文简介[J].自动化学报,1981,01:69-76.
[25]周娟.新媒体时代下的湖南传媒产业发展研究[D].湖南师范大学,政治经济学,2014,硕士.
[26]付旭平.基因芯片数据分析[D].复旦大学,2005.
[27]王雪芬.长期施肥对红壤基本性质、有机碳库及其化学结构的影响[D].南京农业大学,生态学,2012,硕士.
[28]黄喜德.集团客户营销战略研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]达龙.报人林白水平民化新闻思想研究[D].河北大学,新闻学,2014,硕士.
[30]刘鹏程.光伏并网发电系统及其控制的研究与仿真[D].中原工学院,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[31]丁学杰.PC应用中一个值得注意的问题[J].冶金自动化,1991,02:49-51.
[32]杨涛.用于微网系统的储能变流器研究[D].北京交通大学,2014.
[33]黎氏玄莊.唐诗翻译与越南诗歌体裁之形成及发展[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2014,博士.
[34]高浩钧.水压充填型溶腔对隧道稳定性影响的研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[35]戴伟,高佳琪,曹罡,欧阳峰.深圳市郊区大气中PM_(2.5)的特征分析[J].环境科学,2012,06:1952-1957.
[36]钱立立.农药残留的快速检测和前处理技术的研究[D].中国科学技术大学,2007.
[37]刘开第,庞彦军,周少玲,栗文国.一种无监督数据驱动的学习算法[J].控制与决策,2009,03:472-476.
[38]许程明.基于C/S和B/S结构的研究生就业管理信息系统开发[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2003,硕士.
[39]杨建玲.黄蜀葵查尔酮合成酶基因的克隆[D].中国农业科学院,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[40]张弛.国内休闲旅游景区虚拟旅游应用研究[D].北京林业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[41]常翠祖.磁性掺杂拓扑绝缘体量子阱薄膜制备及性质研究[D].清华大学,2012.
[42]王源.一种基于Simhash的文本快速去重算法[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[43]王永必.60kA电解铝微机过程自动控制系统[J].冶金自动化,1993,01:23-25+22-60.
[44]张海波,蒋良敏,陶文伟,郭子健,张鹏飞.实用化分布式动态潮流计算系统的设计与实现[J].电力系统自动化,2012,09:67-71+76.
[45]李承轩.CCl_4在离子液体中的溶解及其在水溶液中的催化降解研究[D].河南科技大学,应用化学,2014,硕士.
[46]丁祎.马克思主义生态观视野下临汾市经济可持续发展问题研究[D].山西师范大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[47]王宇峰.实习学生人身伤害赔偿案例分析[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[48]杨帅.碳纳米管复合纳米材料修饰电极的制备及其应用研究[D].上海师范大学,2013.
[49]马爱梅.东莨菪碱对实验性大鼠惊厥阈值、惊厥行为及脑内部分神经递质的影响[D].山西医科大学,神经病学,2002,硕士.
[50]马施卫.地下水封油库三维可视化安全监测信息系统的研制[D].中国地质大学（北京）,岩土工程,2014,硕士.